Du prélèvement à la lame blanche

Le but final de la technique est d'obtenir des coupes minces et régulières dans lesquelles les éléments des tissus sont maintenus intacts dans leur morphologie et dans leur rapport.
Pour y parvenir, il aura fallu, dès la biopsie, plonger le prélèvement dans un liquide fixateur qui bloque les réactions enzymatiques et qui stabilise les structures.
Puis, afin de pouvoir réaliser des coupes sans écrasement, il faut incorporer aux tissus une substance neutre et solidifiable, la paraffine, carbure d’hydrogène saturé qui possède les propriétés suivantes :

- solide à la température ambiante,
- liquide à une température supérieure à 56°C,
- insoluble dans l’eau et l’alcool,
- soluble dans les hydrocarbures (toluène, xylène, chloroforme, essences...).

Les différentes étapes sont :

Substitution de l'eau des tissus par la paraffine
Inclusion en bloc
Coupe au microtome
Étalement
Séchage

Dans certains cas (urgence ou coloration particulière), il est possible de réaliser directement sur le prélèvement :

Coupe au cryostat

1 - La substitution de l'eau des tissus par la paraffine

Trois temps se succèdent : déshydratation, clarification puis imprégnation. Ils utilisent la propriété de miscibilité des solvants entre eux. Ce procédé est adapté à des pièces de moins de 1 cm d’épaisseur, quelles que soient leurs surfaces.
A la fin de chaque temps d’incubation dans un bain, la teneur en solvant ou paraffine doit être la même dans le bac et dans le prélèvement.
Les conditions de traitement optimales sont atteintes :

- en multipliant les bacs de solvant propre,
- en agitant les prélèvements dans les bains,
- en adaptant les temps d’incubation à la taille des prélèvements.

Déshydratation

Elle est progressive et a lieu dans des bains d’alcool éthylique de degrés croissants jusqu’à l’alcool absolu.

Clarification ou éclaircissement

Elle consiste à remplacer l'alcool absolu par un solvant miscible à l'alcool et à la paraffine.

Imprégnation

Cette dernière étape aboutit à la substitution du solvant par la paraffine liquide.

2 - L'inclusion en bloc de paraffine

Le résultat de cette technique permet d’obtenir un bloc d’inclusion.
Les prélèvements imprégnés sont enrobés dans la paraffine.
La prise en masse de la paraffine se fait dans un récipient permettant le démoulage du bloc.
La coupe sera facilitée si la pièce est centrée dans le moule et la cassette solidement fixée dans la paraffine.
Toutes les structures composant le prélèvement pourront être observées si la pièce est bien orientée en fonction de l’organe et si la face du prélèvement à couper est bien aplanie.
L’identification de la cassette doit être parfaitement lisible.

Produits et matériels

Prélèvements imprégnés de paraffine
Réserve de paraffine chaude et propre avec pompe distributrice
Bacs de paraffine chaude contenant les prélèvements prêts à inclure
Plaque de refroidissement
Pinces plates
Moules inox

Technique

Retirer la cassette contenant le prélèvement de la paraffine liquide.
Poser cette cassette sur la surface chaude du module de distribution.
Couler de la paraffine propre dans le moule chaud jusqu’au rebord de pose de la cassette.
Prendre le prélèvement avec une pince chaude et le poser dans le fond du moule.
Poser simultanément moule contenant paraffine et prélèvement sur la plaque froide.
Orienter le prélèvement tout en le maintenant au fond du moule en effectuant une pression régulière et «maîtrisée» sur la totalité du fragment.
Poser sur le moule la cassette portant l’identification du prélèvement.
Compléter de paraffine liquide par dessus la cassette.
Poser l’ensemble sur la plaque de refroidissement.
Laisser la paraffine prendre en masse totalement.
Démouler et enlever l’excédent de paraffine autour de la cassette.

3 - La coupe au microtome

Le résultat de cette technique permet d’obtenir un ruban de quelques coupes reliées.
Les coupes en paraffine se font selon le principe du «rabotage».
Si les copeaux trop épais s’enroulent et se craquèlent, les copeaux minces viennent intacts, à peine incurvés voire plans.
Deux faces supérieure et inférieure du bloc doivent être positionnées parallèlement au fil du rasoir.
Le bord supérieur de la coupe (n) reste sur le tranchant du rasoir, la coupe (n+1) au fur et à mesure qu’elle se forme entraîne la coupe (n). Le ruban se forme ainsi.
La face du ruban directement en contact avec le rasoir est brillante. C'est elle qui sera posée sur la lame porte objet.

Produits et matériels

Prélèvements inclus en paraffine dans une cassette parfaitement identifiée
Microtome
Lames de rasoir jetables et support de lames si nécessaire
Bistouris

Technique

Vérifier le blocage du volant du microtome.
Reculer le cylindre d’avance du porte objet.
Insérer la cassette dans la pince.
Fixer le porte lame de rasoir ou la lame de rasoir.
Régler l’angle de coupe à environ 45°.
Régler les parallélismes (vertical et horizontal) du bloc par rapport au fil du rasoir.
Contrôler tous les blocages :
- blocs
- lames de rasoirs
- porte rasoir.
Régler l’épaisseur de coupe pour dégrossir le bloc.
Libérer le volant puis éliminer le «mur» de paraffine qui recouvre la pièce.
Régler l’épaisseur de coupe à 4 µm pour former le ruban qui sera conservé.
Tourner le volant régulièrement.
Décoller du rasoir un ruban de 5 à 6 images, à l’aide du bistouri.
Poser le ruban sur une feuille de papier.
Identifier le ruban.
Bloquer le volant puis protéger le fil de la lame de rasoir avant de changer de bloc.

4 - L'étalement

L’étalement consiste à coller les images sélectionnées sur la lame porte objet.
Afin de faciliter l’adhérence du prélèvement sur la lame, il faut aplanir le ruban en ramollissant la paraffine sans la faire fondre et interposer une solution filtrée d’albumine glycérinée à 1%.

Produits et matériels

Solution d’albumine glycérinée à 1% fraîchement préparée et filtrée
Platine chauffante
Bistouri
Deux aiguilles montées (pointue et lancéolée)
Lames porte objet propres et dégraissées
Portoir de lames plat

Technique

Choisir la (les) image(s) à étaler.
Séparer cette sélection en coupant de chaque côté avec le bistouri propre.
Poser une lame sur la platine maintenue à une température permettant un ramollissement de la paraffine sans la faire fondre.
Recouvrir la lame de solution albumineuse.
Poser progressivement le ruban sur l’eau albumineuse en commençant par le bord droit puis en étirant légèrement avant de le lâcher.
Éliminer les derniers plis si possible en tirant sur la paraffine et non sur le prélèvement à l'aide des aiguilles.
Recommencer sur une autre partie du ruban s'il reste des plis.
Égoutter l’excès de solution albumineuse dans un bécher en inclinant la lame.
Identifier la lame avant de procéder au séchage.

5 - Le séchage

Seule une lame bien égouttée pourra être séchée dans de bonnes conditions.
Une lame est sèche lorsque la coupe est transparente sans d’effet «miroir» entre la coupe et la lame.

Produits et matériels

Lames porte objet avec coupes collées
Étuve à 45°C ou à 37°C ou four à micro-ondes
Portoir de lames plat
Panier en verre

Technique

Disposer les lames dans un panier en verre.
Placer ce panier :
- 1 heure minimum dans une étuve à 45°C,
- ou 1 nuit dans une étuve à 37°C,
- ou 10 minutes dans un four à micro-ondes réglé à la puissance 700 W avec un bécher de 250 ml rempli d’eau froide.

6 - La coupe au cryostat

Cette technique est utilisée en extemporané quand le résultat de l'analyse de la biopsie est urgent ou que les éléments recherchés sont solubles ou sensibles aux effets du fixateur et/ou des produits de substitution.
Le prélèvement n'est pas fixé. Il est immédiatement envoyé au laboratoire pour être congelé, coupé, puis éventuellement fixé, et enfin coloré.

Produits et matériels

Prélèvements identifiés, non fixés.
Microtome dans une enceinte réfrigérée (cryostat)
Lames de rasoir jetables et support de lames si nécessaire ou rasoirs
Gants anti coupure et gants latex
Lames porte objet

Technique

Bloquer le volant.
Congeler le prélèvement entre -18°C et – 20°C.
Fixer le plot dans la pince du microtome.
Contrôler tous les blocages :
- blocs
- rasoirs
- porte rasoir.
Lever la plaque anti-roll.
Dégrossir afin d’avoir toute la surface du prélèvement.
Régler l’épaisseur de coupe (5 µm).
Essuyer le rasoir sans le réchauffer.
Poser délicatement la plaque anti-roll sur le fil du rasoir.
Réaliser une à deux coupes en tournant le volant.
Récupérer la coupe sur une lame porte objet après avoir soulevé la plaque anti-roll.
Sécher la coupe à l’air.
Identifier la lame qui est ainsi prête pour la coloration.